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外周血染色体制备

作者:上海赛伟生物科技有限公司 2008-11-16T00:00 (访问量:5245)

外周血染色体制备

 

一、试剂准备

1.培养液

2.0.2%肝素溶液

3.0.0005%秋水仙酰胺溶液(黑纸包裹避光置4℃冰箱保存)

4.0.075mol/L氯化钾溶液

5.3:1甲醇、冰醋酸固定液(临用前配制)

6.10%Giemsa染色液

7.2%PHA溶液

二、操作程序

1.标本采集。用肝素润湿的针筒采静脉血1ml,混匀后注入两瓶含5ml培养液的标本瓶中,每瓶0.3~0.5ml。

2.加PHA。每瓶培养液加入PHA溶液0.2ml。

3.培养。标本混匀后置37℃温箱培养72h,每日早晚定时摇匀培养物1次。

4.阻留中期分裂相。于终止培养前2-4h加入秋水仙酰胺,终浓度为0.1µg/ml。

5.收获细胞。将培养物吸至尖底离心管,离心,1000转/min,10min。

6.低渗。吸去上清液,加入预温至37℃的0.075mol/L KCL溶液6~8ml,用吸管吹打混匀后置37℃温箱15min。

7.预固定。加入3:1甲醇、冰醋酸固定液1ml,吹打混匀。

8.离心。1000转/min,10min。

9.固定。吸去上清液,加新鲜配制的3:1甲醇、冰醋酸固定液6~8ml,吹打混匀。

10.离心。1000转/min,10min。

11.重复9、10步骤两遍,使细胞经过3次固定,除第一次固定至少30min外,其余两次固定,每次15min或30min均可。

12.细胞悬液的制备和保存。吸去上清液,加入适量固定液,制成浓度合适的细胞悬液。此液置-20℃冰箱中可保存1至数年。在此期间可随时取出,供各种显带处理或FISH检测之用。

13.制片。用吸管将细胞悬液轻轻打匀后吸取少量,从10cm高处滴至一端倾斜15º的经冰水或20%乙醇浸泡过的洁净无脂的玻片上,每片滴2~3滴,然后在酒精灯上焰上来回通过数次,使其干燥。

14.染色。标本采用10% Giemsa染色液染色20~30min,流水冲洗,待干,镜检。剩余标本置4℃冰箱或-20℃冰箱备做各种显带之用。

三、注意事项

1.培养液的PH以7.3±0.1为佳,偏酸则细胞生长不良,偏碱则细胞固缩。

2.温度应严格控制在37±0.5℃。

3.所有试剂均应采用分析纯产品和三蒸水配制。

4.所有玻璃器皿要求绝对干净,无酸。

5.操作程序1~4需注意无菌技术,严防细菌和病毒污染。

6.外周血染色体制备主要用于检测体质性核型异常。若白血病患者白细胞数>10×109/L,原始细胞>10%,也可采用不加PHA的外周血培养,其操作程序与外周血染色体制备大致相同,不同之处在于:①秋水仙酰胺终浓度为0.05μg/ml,处理1h;②低渗时间延长至30min。
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