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骨髓细胞染色体制备

作者:上海赛伟生物科技有限公司 2008-11-16T00:00 (访问量:6629)

骨髓细胞染色体制备   

 骨髓染色体标本制备通常用于白血病患者,特别是慢性或急性粒细胞性白血病,因为骨髓反映粒系统细胞增生情况,这些病人不宜用外周血。即使是淋巴细胞性白血病,也不主张用外周血,因为加PHA刺激外周血培养,只能获得正常淋巴细胞分裂相,并不能反映那些病理淋巴细胞的染色体改变。骨髓细胞属不断增殖的细胞,培养可分短期培养和直接制片法,无论哪种其培养液中均不需加PHA。

一、直接法

(一)试剂准备

1.PH7.4的PBS或0.9%的生理盐水20ml。

2.0.2%肝素。

3.0.0005%秋水仙酰胺溶液。

4.0.075mol/L KCL溶液

5.3:1甲醇、冰醋酸溶液。

6.10%Giemsa染色液。

(二)操作程序

1.标本采集。用肝素湿润的针筒抽取骨髓2ml或更多,立即注入含1640培养基的标本瓶中。

2.细胞接种。将标本瓶带回实验室后,先做骨髓有核细胞计数,再按8×106/ml的细胞密度注入标本瓶中,然后补充PH为7.4的PBS或0.9%NS至20ml。

3.阻留中期分裂相。立即加入秋水仙酰胺,终浓度为0.05μg/ml,摇匀后置37℃温箱中1h。

4.收获细胞。将培养物吸至尖底离心管,离心,1000转/min,10min。

5.低渗。弃上清液,沿管壁缓缓加入预温37℃的0.075mol/L KCL溶液6~8ml,吹打混匀后置37℃温箱30min。

6.预固定。加入3:1甲醇、冰醋酸固定液1ml,吹打混匀。

7.离心。1000转/min,10min。

8.固定。吸去上清液,加新鲜配制的3:1甲醇、冰醋酸固定液6~8ml,吹打混匀。

9.离心。1000转/min,10min。

10.重复9、10步骤两遍,使细胞经过3次固定,除第一次固定至少30min外,其余两次固定,每次15min或30min均可。

11.细胞悬液的制备和保存。吸去上清液,加入适量固定液,制成浓度合适的细胞悬液。此液置-20℃冰箱中可保存1至数年。在此期间可随时取出,供各种显带处理或FISH检测之用。

12.制片。用吸管将细胞悬液轻轻打匀后吸取少量,从10cm高处滴至一端倾斜15º的经冰水或20%乙醇浸泡过的洁净无脂的玻片上,每片滴2~3滴,然后在酒精灯上焰上来回通过数次,使其干燥。

13.染色。标本采用10% Giemsa染色液染色20~30min,流水冲洗,待干,镜检。剩余标本置4℃冰箱或-20℃冰箱备做各种显带之用。

(三)注意事项

1.骨髓直接法应在标本采集后1h内进行,超过此时间则细胞活力下降而致分裂相少见。

2.骨髓直接法的效果好坏与细胞接种关系不大,因此若不准备进行培养者,骨髓抽吸后可立即注入20ml生理盐水中,而不需要作骨髓有核细胞计数。

3.骨髓细胞染色体制备和外周血染色体制备最主要的不同在于:①秋水仙酰胺终浓度和处理时间:前者0.05μg/ml×1h,后者0.1μg/ml×2~4h;②低渗时间;前者30min,后者15min。

二、短期培养法

(一)试剂准备

1.培养基的配制和保存。同外周血染色体制备[第二部分第五章一]。

(二)操作程序

1.细胞接种。将标本瓶带回实验室后,先做骨髓有核细胞计数,再按1~3×106/ml的细胞密度注入标本瓶中,然后补充PH为7.4的PBS或0.9%NS至20ml。

2.细胞培养。将培养瓶放入37℃温箱中持续培养24或48h,其间定时摇匀培养物。

3.阻留中期分裂相。于终止培养前2-4h加入秋水仙酰胺,终浓度为0.1µg/ml。

4.收获细胞。将培养物吸至尖底离心管,离心,1000转/min,10min。

5.低渗。吸去上清液,加入预温至37℃的0.075mol/L KCL溶液6~8ml,用吸管吹打混匀后置37℃温箱15min。

6.预固定。加入3:1甲醇、冰醋酸固定液1ml,吹打混匀。

7.离心。1000转/min,10min。

8.固定。吸去上清液,加新鲜配制的3:1甲醇、冰醋酸固定液6~8ml,吹打混匀。

9.离心。1000转/min,10min。

10.重复9、10步骤两遍,使细胞经过3次固定,除第一次固定至少30min外,其余两次固定,每次15min或30min均可。

11.细胞悬液的制备和保存。吸去上清液,加入适量固定液,制成浓度合适的细胞悬液。此液置-20℃冰箱中可保存1至数年。在此期间可随时取出,供各种显带处理或FISH检测之用。

12.制片。用吸管将细胞悬液轻轻打匀后吸取少量,从10cm高处滴至一端倾斜15º的经冰水或20%乙醇浸泡过的洁净无脂的玻片上,每片滴2~3滴,然后在酒精灯上焰上来回通过数次,使其干燥。

13.染色。标本采用10% Giemsa染色液染色20~30min,流水冲洗,待干,镜检。剩余标本置4℃冰箱或-20℃冰箱备做各种显带之用。

(三)注意事项

1.细胞密度以1~2×106/ml左右为宜。

2.远距离运送的标本必须在24h内投入培养。

3. 改良方法有以下两种,可任择其一:①收获细胞前6h加入10-5mol/L的胸腺嘧啶核苷(Tdr),秋水仙酰胺处理时间缩短为10~30min;②收获细胞前2h加入终浓度为10μg/ml的溴乙锭,秋水仙酰胺处理时间不变。

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