在上一篇文章《活体成像技术应用之实验方法选择》中介绍了活体成像技术的实验方法主要包括生物发光(bioluminescence)和荧光(Fluorescence)两种技术。生物发光技术是用荧光素酶(Luciferase)基因标记细胞或者DNA，而荧光技术则是应用荧光蛋白(如GFP,RFP等)对细胞或者DNA进行标记。

文章发出之后，得到了很多老师的一些反馈意见。其中有一位老师对于使用GFP荧光蛋白进行成像给出了一些建议，这位老师这样说到：活体荧光成像由于观测位置和深度不一样，激发光和发射光均非常容易收到组织吸收。而GFP这类短波荧光蛋白在进行体表浅层成像的效果还可以，但是深层脏器是非常不推荐的。收到老师的意见后，我们在文章《活体成像技术应用之实验方法选择》后面及时增加了相关补充说明，供老师们综合考虑选择。

确实如这位老师所说，哺乳动物组织的透明度是由血红蛋白和黑色素的特性决定的，它们可以吸收650nm以下的大部分光，而水会吸收900nm以上波长的光。换句话说，650 nm至900 nm之间的波长将基本上不受阻碍地穿过动物和人体组织。因此对于深层脏器成像观察，可以考虑使用近红外荧光蛋白(nearinfraredfluorescent protein，iRFP)，原因是iRFP的最大激发和发射波长分别为690 nm和713 nm。

吉凯基因提供带有luciferase, GFP, iRFP等不同报告基因的慢病毒工具，各位老师可以根据需求及仪器情况选择合适的慢病毒进行成像观察。简单来说，可以使用GFP可进行活体观察或者常规显微镜观察；使用luciferase或者iRFP可进行非侵入性生命成像。具体的：

1、 luciferase, GFP, iRFP推荐用于小动物活体成像研究，但是荧光蛋白不建议用于整个小动物的成像；

2、 如果您需要检测尽可能少的细胞，例如识别逃避治疗的少量肿瘤细胞，请选择高度敏感的报告基因。 在小鼠和小型动物中，luciferase（生物发光）具有出色的敏感性；

3、 如果您需要区分不同的肿瘤结节或精确定位溶瘤病毒感染的肿瘤区域。GFP可提供最高的分辨率，但仅限于动物的非常有限的区域；

4、 GFP，iRFP，luciferase在哺乳动物中具有免疫原性，如果您的研究需要免疫功能模型，尤其是纵向研究，建议使用非免疫原性报告基因；

5、 不同报告基因的信号穿透深度不同，在特定器官中，某些报告基因的信号背景可能是问题。比如GFP，由于动物自身发光，导致动物本身会有很高的背景，因此不利于深部组织成像，此时可以考虑使用iRFP，luciferase；

6、 由于成像设备价格昂贵，因此要考虑您所在机构可以使用的成像设备。iRFP，luciferase需要用配有冷却CCD相机的光学成像仪成像。其他荧光蛋白（例如eGFP，DsRed）也可以使用光学成像仪成像，但是由于背景自发荧光较高，不建议进行动物整体成像；

7、 对于使用iRFP和其他荧光蛋白进行成像，需要确认设备是否具有所用特定荧光蛋白所需的必要的激光/光源和滤光片组；

8、 荧光蛋白（包括iRFP）的成像不需要其他试剂，而luciferase成像需要底物d-luciferin；

参考文献：

1. Bright and stable near-infrared fluorescent protein for in vivo imaging. Filonov et al (Nat Biotechnol. 2011 Jul 17. doi: 10.1038/nbt.1918.)

2. Noninvasive, infrared monitoring of cerebral and myocardial oxygen sufficiency and circulatory parameters. Science 198, 1264–1267 (1977)