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CIK细胞制备方法及细胞因子的作用

作者:翌圣生物科技(上海)股份有限公司 2024-07-18T00:00 (访问量:44033)

 

背 景

 

CIK是“Cytokine-Induced Killer Cells”的缩写,中文全称为“细胞因子诱导的杀伤细胞”。CIK细胞来源于CD3+CD56-T细胞, 是激活的Ⅱ型T淋巴细胞且同时兼具NK细胞的杀伤特性。但CIK细胞在外周血中含量甚微(约1%-5%)。因此要将CIK细胞用于临床治疗, 首先必须进行大量扩增。CIK细胞的产生过程大致如下:利用密度梯度离心法将患者或健康人外周血中单核细胞分离出来后, 通过添加外源性细胞因子如IFN-γ、IL-2、IL-1、CD3单抗进行体外诱导扩增。体外扩增2周-4周后, 培养基中出现大量具有强抗癌活性的异质细胞群, 即为CIK细胞。CIK细胞具有杀瘤活性高、杀瘤谱广,对正常组织毒性低,体外可高度扩增等特点。该细胞对肿瘤细胞的辨认能力非常强,好像 “ 细胞导弹 ” ,能 “ 点射 ” 肿瘤细胞,但不会伤及 “ 无辜 ” 的正常细胞。因而,CIK 细胞治疗是目前临床上广泛使用的过继性免疫治疗细胞。

 

图1.CIK细胞制备流程[1]

 

 

 

CIK培养用细胞因子和抗体

 

白细胞介素-2 (IL-2 )

IL-2是引起T细胞增殖最重要的细胞因子。IL-2通过其受体共用链IL-2Rβ链和γ链, 经Jak/Stat信号转导通路参与细胞增殖, 同时促进NK细胞和T细胞定向分化为效应细胞发挥杀伤作用。

 

干扰素-gama (IFN-γ )

FN-γ对提高细胞毒活性非常重要, 不同的添加顺序与细胞毒活性密切相关。将IFN-γ添加在IL-2之前可以明显提高细胞毒活性, 其机制在于IFN-γ可以诱导外周血淋巴细胞表面IL-2受体(IL-2R)的高表,从而会增强T细胞对IL-2促增殖反应的敏感度和强度。

 

白细胞介素-1a(IL-1a)

IL-1a也可以提高外周血淋巴细胞表面IL-2R的表达。当IL-1a与IFN-g和激发型CD3单抗合用时,可以明显提高CIK 的细胞毒作用。

 

CD3激发型单抗

T细胞活化的第一信号来自于T细胞表面的受体,即T细胞抗原受体(T cell antigen receptor, TCR)与APC提呈的抗原的特异性结合,也就是T细胞对抗原的特异性识别。CD3分子在T细胞活化信号的转导中起着极其关键的作用。CD3激发型单抗与T细胞表面CD3分子特异性结合后,可引起CD3分子胞浆区ITAM基序中酪氨酸的磷酸化,进而导致T细胞增殖和活化的下游信号的激活,从而使T细胞增殖和活化。也就是说,CD3激发型单抗能够模拟抗原与TCR/CD3复合物的识别和激活过程,从而引起T细胞的增殖与活化,因此是CIK细胞培养中不可或缺的刺激因素。


此外,CD3激发型单抗需要注意克隆号。克隆号为OKT3的CD3激发型单抗可以刺激所有人的T细胞的增殖,而其它克隆号的CD3激发型单抗仅能刺激一部分人的T细胞。因此,在进行CIK培养时,最好选用OKT3克隆。

 

 

 

 

细胞制备

 01

外周血单个核细胞的采集

  

用血细胞分离机采集患者自身的外周血单个核细胞50-100mL;

 

淋巴细胞分离液密度梯度离心法进一步纯化单个核细胞(PBMC);

 

无血清培养液洗涤2次,获得纯度在90%以上的PBMC。

 

 

02

CIK细胞的培养

  

将PBMC按1-2 x 106/ml的浓度悬浮于无血清培养液中,加入1,000 U/ml 的重组人IFN-g,37℃,5%CO2培养箱中培养;

 

24h后加入50ng/ml的CD3 单克隆抗体和300 U/ml 的重组人IL-2,刺激CIK 细胞的生长和增殖;此时也可同时加入100 U/ml的重组人IL-1a;

 

每3天半量换液或扩瓶一次,并补加重组人IL-2  300 U/ml;

 

在培养的第14d,收获CIK细胞。

 

 

03

CIK细胞质控

  

台盼蓝染色检测:活细胞应在80%以上;

 

流式细胞仪检测细胞表面CD3、CD8、CD56等分子的表达:CD3+CD56+细胞的比例应在20%以上;

 

细胞杀伤实验:以CIK细胞为效应细胞,以肿瘤细胞(可为原代肿瘤细胞或肿瘤细胞株)为靶细胞,将效应细胞与靶细胞按10 : 1(数目比) 的比例加入96 孔U 型板中,每孔含靶细胞1 x 104个,终体积为200 ml,设3个复孔。培养4h,然后取培养上清,用乳酸脱氢酶(LDH) 试剂盒检测效应细胞对靶细胞的杀伤率。

 

收获细胞前,取少量培养物进行细菌、真菌培养,并检测支原体、衣原体,及内毒素。

 

 

 

 

推荐试剂

 

 

应用

产品名称

货号

规格

CIK细胞培养

Human IL-2

90103ES

10μg/100μg

Human IFN-gama

91207ES

20μg/50μg/100μg

Human IL-1α

90100ES

2μg/10μg/50μg

CIK细胞质控

台盼蓝染色法细胞活力检测试剂盒

40208ES

100T/500T

内毒素检测试剂盒

60401ES06

17T

一步法快速支原体检测试剂盒

40612ES

25T/100T

 乳酸脱氢酶(LDH)细胞毒性检测试剂盒

40209ES76

500 T

 

 

参考文献

[1] Jingting Jiang, Changping Wu &Binfeng Lu .Cytokine-induced killer cells promote antitumor immunity[J]. Journal of Translational Medicine volume 11,

 

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