克隆是英文“clone”或“cloning”的音译，而英文“clone”则起源于希腊文“Klone”，原意是指以幼苗或嫩枝插条，以无性繁殖或营养繁殖的方式培育植物，如扦插和嫁接。
1963年J.B.S.Haldane在题为“人类种族在未来二万年的生物可能性”的演讲上采用“克隆（Clone）”的术语，把“克隆技术”带到了人们的视野中，其本身的含义是无性繁殖。
克隆技术又称为“生物放大技术”，它经历了三个发展时期：
01
微生物克隆时期
即用一个细菌可以很快复制出成千上万个和它一模一样的细菌，从而变成一个细菌群，是个体水平上的克隆；
02
生物技术克隆时期
比如用遗传基因——DNA进行克隆，是分子水平上的克隆；
03
动物克隆时期
即由一个细胞克隆成一个动物，是细胞水平上的克隆。克隆绵羊“多莉”就是使用动物克隆技术从一头母羊的体细胞克隆而来的。
目前应用最广泛的技术为“分子克隆”，又称重组DNA技术，是将目的DNA片段按照人们的设计定向连接起来，在特定的受体细胞中与载体同时复制并得到表达，产生新的遗传性状。
传统分子克隆实验流程如下图：
图1.传统分子克隆实验流程
01
载体制备
- 载体：将目的DNA序列通过基因工程手段送到受体细胞所需的运载工具。常见的载体有质粒，病毒和噬菌体。当前基因工程中最常用的载体是质粒。
所有基于质粒的克隆载体包括：确保在细菌宿主细胞内能有效增殖的复制原；单一酶切位点，或多克隆位点（MCS），后者含有一系列酶切位点，可供目的片段插入；载体成功转化后的细菌筛选标记（例如，抗生素耐受）。
传统分子克隆载体制备的第一步是通过限制性酶切构建插入位点。限制性内切酶的选择取决于载体和插入片段上是否存在相应的识别序列、识别序列的位置以及是否适于连接。MCS往往是插入片段的首选，因为该区域专用于克隆。
翌圣的FuniCut™快速限制性内切酶能快速、精准完成DNA切割。载体酶切后，为防止自连，可能有必要进行载体的去磷酸化，尤其当载体酶切后末端可互补或是平端时。载体的去磷酸化对于降低背景、促进所需片段插入载体非常重要。
图2.FuniCut™快速限制性内切酶
（Cat#15001ES-15051ES）
- 快速：5-15 min内精确完成DNA切割
- 适用性广：可以切割质粒DNA、PCR产物和基因组DNA等
02
插入片段制备
克隆的插入片段来源可能为基因组DNA、另一质粒的一部分或者线性DNA片段。制备插入片段时常用的步骤是选择适于将插入片段克隆进载体的限制性内切酶，进行限制性酶切，产生匹配的粘性末端，以便接下来将片段插入在载体中。对插入片段和载体进行双酶切，以实现定向克隆。
插入片段和载体经酶切后，可在琼脂糖凝胶上进行电泳并切割出目标片段，纯化所需的片段。使用翌圣的琼脂糖凝胶回收试剂盒（Cat#19101ES）能保证实验流程高效、结果可靠、得率高。
制备插入片段另一个方法是通过高保真PCR（翌圣高保真PCR Cat#10164ES）试剂扩增所需要的插入片段，可加入相应的酶切位点或同源重组片段，纯化后进行连接。
03
连接
获得目标片段后，可以构建连接反应，连接插入片段和载体。常用的连接酶为T4 DNA连接酶、拓扑异构酶。T4 DNA连接酶可连接DNA末端的5’-磷酸基和3’-羟基。
拓扑异构酶是指通过切断DNA的一条或两条链中的磷酸二酯键，然后重新缠绕和封口来更正DNA连环数的酶，需根据DNA片段的末端为粘性末端或者平末端来选择不同的TOPO克隆试剂盒，如翌圣TOPO克隆系列—TA/Blunt（Cat#10907-10910）。
图3.Hieff Clone ® Zero TOPO-Blunt Cloning Kit（Cat#10907）可有效克隆1-5 kb基因，成功率100%。
注：A-C：TOPO克隆转化平板；D-F：插入片段PCR鉴定电泳图。
不经过酶切的片段可使用 同源重组酶 连接到线性载体上。首先将载体线性化，并在插入片段正、反向PCR引物5’端引入15-25 bp的线性化载体末端同源序列，使得插入片段PCR产物5’和3’末端分别带有与线性化载体两末端对应的完全一致的序列。PCR产物和线性化载体在重组酶的作用下，经过一定的时间和温度即可进行转化，完成定向克隆。
同源重组酶可连接单片段或者多片段，根据插入片段数的不同，选择不同的一步法快速克隆试剂盒，如翌圣的 Hieff Clone ® Plus One Step Cloning Kit一步法快速克隆试剂盒（Cat#10911ES）、Hieff Clone ® Universal One Step Cloning Kit通用型一步法快速克隆试剂盒（Cat#10922ES） 。
图4.同源重组原理
图5.Hieff Clone® Plus One Step Cloning Kit（Cat#10911ES）试剂盒可以有效克隆不同长度的单片段基因
注：载体：4.7 kb；插入片段：1.2 kb，3 kb和5 kb。
04
转化
转化是细菌细胞低频率吸收外界DNA的自然过程。在分子生物学实验中，用来在专门为吸收DNA而制备的“感受态”细菌内增殖质粒。可根据下游应用的不同，选择不同的感受态细胞，常见的有DH5α化学感受态、TOP10化学感受态、BL21(DE3)化学感受态、根癌农杆菌感受态等。
市面上提供可实现高效、可靠转染的感受态细胞。制备可进行转化的“感受态”细菌的最常用方法是采用氯化钙处理对数期细菌细胞。将化学感受态细胞和连接反应物混合，然后在42°C下热激活，部分DNA会被细菌细胞吸收，并在细胞内开始复制。为了加快感受态转化的流程，市面上也有应运而生的快速感受态，如翌圣F DH5α化学感受态（Cat#11803ES），10分钟就能完成快速转化。
图6.感受态转化流程
随后，将转化的细菌置于含有适量抗生素的琼脂板上，通过蓝白斑筛选或其它方法筛选含有所需质粒及插入片段的菌落。
05
克隆筛选
转化反应的菌液中，同时包含不带载体的细胞、不含插入片段的载体、纯插入片段、以及成功连接的载体和插入片段。为了获得连接成功的载体和插入片段，可通过含有抗生素的平板进行筛选，不含载体的细菌缺少抗生素耐受性基因，因而不会生长。
但经转化后含有载体的细菌，不论带或不带插入片段都能表达抗生素耐受性基因，因而可存活。为确定转化的菌落是否含有插入片段，可采用多种方法，其中最常用的是蓝白斑筛选法和阳性克隆筛选法。
蓝白斑筛选法，将经转化的细胞涂布到含有lacZ转录诱导子、IPTG（Cat#10902ES）、X-gal（LacZ显色底物，Cat#10901ES）的生长培养基上，LacZ会水解X-gal，产生蓝色染料进而形成蓝色菌落。当插入片段破坏了载体编码的lacZα基因时，无法形成功能性LacZ，经转化的菌落呈白色。
图7.蓝白斑筛选原理
阳性克隆筛选法，即在载体的MCS之中含有一个对于细菌宿主致命的基因。当插入片段成功连接到MCS内的致命基因内，可阻止其表达，从而确保只带有插入片段载体的转化细胞才能存活。
图8.阳性克隆筛选原理
为了进一步验证，还需要对从阳性菌落或白色菌落中提取的载体进行酶切，进行凝胶电泳，确定其条带图谱是否与所插入目的片段的条带大小一致。还可通过菌落PCR法判断DNA片段是否插入（翌圣快速PCR Cat#10157ES）；或通过测序确定插入片段基因是否突变等。
通过上述对“分子克隆技术”的介绍，相信大家已经充分认识到“分子克隆技术”在生物学研究领域是如基石一样的存在，它的出现和应用开辟了分子遗传学研究的新领域，作为生物技术界的顶流，它打开了人类了解、识别、分离和改造基因，创造新物种的大门。它的成就对于工业、农牧业和医学产生深远影响，并将为解决世界面临的能源、食品和环保三大危机开拓一条新的出路。相信大家能通过这门技术，为世界探索真理、创造美好未来。
